小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒

产品编号#：SEKM-0034
适用于小鼠血清、血浆或细胞培养上清液等样本
                                                 

中文名称
小鼠肿瘤坏死因子α检测试剂盒
英文名称
Mouse TNF-α ELISA KIT
反应性
Mouse
样品类型
Serum, plasma, Cell culture supernatant
灵敏度
7 pg/ml
检测目标
TNF-α
应用
Sandwich ELISA

 背景介绍：
    TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。小鼠的TNF-α基因长约2.78kb，由4个外显子和3个内含子组成。成熟小鼠的TNF-α分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成。鼠与人的 TNF-α有79％氨基酸有同源性，TNF-α的生物学作用无明显的种属特异性。TNF-α的生物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节，对血管和凝血的影响及多种器官（肝、心脏、骨、软骨、肌肉和其它组织）的作用。

检测原理：
    Solarbio (Solarbio ®)ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗小鼠TNF-α单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的小鼠TNF-α会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗小鼠TNF-α抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠TNF-α发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的小鼠TNF-α，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的小鼠TNF-α浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中小鼠TNF-α的浓度。

注意事项：※※※
1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3.试剂盒使用前请在室温恢复30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5.为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.
6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 盖上，使用前请离心处理（5-10 S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。
7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的 试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8.为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。

安全提示：
试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

自备实验器材（不提供，可代购）
1．酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）
2．高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板机或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．双蒸水，去离子水，量筒等
6．稀释用聚丙烯试管

样本收集及储存：
1.细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。
2.血清样本：
室温血液自然凝固20 min后，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3.血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20 min，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：
血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。


试剂准备：
1.试剂回温：首先在实验前30 min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
2.配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
3.标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后按照以下浓度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（2000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4.生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用生物素化抗体稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。




5.酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将40倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。



6.洗涤方法：
自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注与吸出间隔为30秒，洗板5次。
手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

结果判断：
1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。
2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值
3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNF-α含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。

参数表征：


1. 数据及标准曲线

本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠TNF-α的样本含量

2. 灵敏度：
最低可检测小鼠TNF-α浓度达15pg/ml，
20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。

3. 特异性：
不与小鼠M-CSF 、GM-CSF、LIF、SCF、TNF-β、VEGF等反应，人的TNF-α、TNF sRI、TNF sRII等反应

4. 重复性：
板内，板间变异系数<10%

5. 回收率：
在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠TNF-α，计算回收率。


6. 线性稀释：
分别在选取的4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 TNF-α，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。
常见问题及解决方法：