猴肿瘤浸润组织中性粒细胞分离液试剂盒

操作步骤：

1. 制备肿瘤浸润组织的单细胞悬液。

2. 在离心管中加入适量分离液（细胞悬液体积小于5mL时，加入5mL分离液；大于等于5mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）

3. 室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（细胞悬液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。

4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释液；稀释液与分离液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。

5. 小心的吸取分离液层到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min（如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）

6. 弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

7. 重复步骤6

8. 弃上清，细胞重悬备用。

肿瘤浸润组织单细胞悬液的制备方法

肿瘤浸润组织研磨的方法：

1. 无菌条件下摘取肿瘤浸润组织，撕去脏器被膜，用眼科剪将肿瘤浸润组织剪成小块。

2. 将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证肿瘤浸润组织及获得的细胞处于液体环境中）。

3. 将肿瘤浸润组织放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨肿瘤浸润组织（尽量控制研磨力度，保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡）

分离示意图

4. 研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。

注：

A. 可用酶消化法，使用胶原酶对肿瘤浸润组织组织进行消化，得到单细胞悬液。

B. 如果最终得到的细胞需要培养，那全过程所需试剂与器材均要求无菌。

C. 根据肿瘤浸润组织的体积控制单细胞悬液的浓度在10⁸~10⁹个/mL。

注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C. 洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。

D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

E. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。

F. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

参考文献

1. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968; 97: 7.

2. Ting A, Morris PJ. A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun;20(6): 561-3.

3. Boyum A. Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphocytes Tissue Antigens. 1974; 4(4): 269-74.

4. Weisbart RH, Webb WF, Bluestone R, Goldberg LS. A simplified method for lymphocyte separation. VoxSang. 1972; 23(5): 478-80.

5. Recalde HR. A simple method of obtaining monocytes in suspension. J Immunol Methods. 1984 Apr 13;69(1):71-7.

6. BøyumA,LøvhaugD,TreslandL.Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand J Immunol. 1991 Dec; 34(6):697-712.

7. Harris R, Ukaejiofo EO. Tissue typing using a routine one-step lymphocyte separation procedure. Br JHaematol. 1970 Feb; 18(2):229-35.

相关产品：

R1018 细胞洗涤液

S9020 优级胎牛血清

R1017 全血及组织稀释液

31800 RPMI Medium 1640

T1300 胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25%)不含酚红

YA0902 一次性巴氏德吸管

各种其他动物及其他细胞的分离液及试剂盒