酶联免疫吸附试验，也称为ELISA，是酶免疫分析技术中应用最广泛的技术。1971年，Engvall等人发表了一篇利用ELISA定量测定IgG的文章，将1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成为一种定量液体样品中微量物质的方法。

ELISA原理

ELISA的原理包括利用抗原和抗体之间的特异性结合，将抗原或抗体固定在固相载体上。在检测过程中，未结合的物质通常通过洗涤板来去除，酶促反应后底物的颜色用于样品中蛋白质的定性和定量分析。

ELISA中常用的主要试剂

1.抗体: 单克隆抗体特异性强，多克隆抗体结合亲和力高。高端检测试剂盒需要高效配对。

2.抗原: 主要是重组蛋白、细胞因子和测试样本。有效的标准物质需要美国尼伯斯克/世卫组织校准。

3.显色系统: 最初，辣根过氧化物酶(HRP)与TMB和OPD等常见底物形成显色系统。此外，碱性磷酸酶(AP)利用对硝基苯磷酸作为底物产生黄色。葡萄糖氧化酶(GOD)通过葡萄糖氧化酶法产生特定的颜色。最后，β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)利用4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside (4MUG)作为底物产生高强度荧光。

 Figure 1: Schematic Diagram of Common Reagents Used in ELISA

ELISA种类

根据试剂的来源、样品的性质和分析的具体条件，可以设计各种类型的检测方法。根据原理和操作，市场上最常用的方法有:

1. 间接ELISA

这种方法最常用于抗体检测。其原理包括使用酶标记的第二抗体来检测与固相结合的第一抗体，然后进行比色检测。其优点是被检测的第一抗体不需要被标记，使得该过程快速和方便。直接ELISA类似于间接ELISA，但是第一抗体用酶标记。检测孵育也主要涉及抗原。然而，与间接ELISA相比，直接ELISA的灵敏度有限，需要谨慎使用。

Figure 2: Schematic Diagram of Indirect ELISA

2. 三明治夹心ELISA

它进一步分为双抗原夹心ELISA和双抗体夹心ELISA，其用于检测抗体或抗原水平的原理相似。以双抗体夹心ELISA为例，将捕获的抗体包被在固相载体上，加入抗原或检测样品进行结合。随后，加入与抗原结合的检测抗体，形成夹心结构。双抗体夹心ELISA是市场上最常用和最方便的分析方法。

Figure3：Double Antibody Sandwich ELISA Diagram

3. 竞争性ELISA

竞争ELISA通常用于检测小分子抗原和半抗原。样品中存在的抗原越多，结合的酶标记抗原越少，导致竞争性负相关系统。这样一来，比色物质就会少一些。样本中的抗原含量可以基于比色物质的比率来拟合。

Figure 4：Competitive ELISA Schematic

4. 其他方法

a.免疫抑制ELISA: ELISA中测试样品对底物显色的抑制程度与样品中所含抗原的量成正比。两者的区别在于待测抗原的量，类似于竞争性ELISA。

b.阻断ELISA: 也称为竞争性ELISA，这种方法用于检测特异性抗体。其原理包括将抗原包被在固相上，然后在测试样品和酶标记的第一抗体之间进行竞争孵育。测试样品中存在的抗体越多，显色越浅，反之亦然。该方法涉及非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。

c.此外，还有其他ELISA变体，包括用于检测IgM抗体的抗体捕获ELISA、Dot-ELISA(使用硝酸纤维素膜)和C-ELISA(使用聚酯织物),它们涉及固相载体的修饰，以及技术分类，例如TRFIA和多重检测方法。

ELISA试剂盒评估

ELISA试剂盒的质量由多个指标决定。优秀的试剂盒需要评估以下六个主要标准，分析如下:

1. 准确性

a.回收率:校准试剂盒的数据准确性。异常高或异常低的速率可能导致样品分析不准确。

b.线性:试剂盒稀释液和样品微环境的准确性。与预期值的偏差可能表明不准确。

2. 精密度

a.分析内精密度:在单个实验中，评估相同已知浓度的重复孔之间的差异。

b.测定间精密度:评估同一样本的多个实验之间的差异。

3. 灵敏度

检测下限:显著区分空白信号的最小信号值，表示试剂盒的灵敏度。较低的值表示较高的灵敏度。

4. 特异性

a.交叉反应:通过测量不同分子与试剂盒抗体的结合能力来评估特异性。交叉反应性越高，特异性越差。

b.抗干扰能力:评估同源物质和内源性物质对检测系统的干扰。

5. 天然样品检测

天然样品和适当样品类型的检测分析。确定样本类型以避免假阳性或假阴性结果。

6. 稳定性

试剂盒的保质期和稳定性对于确保准确检测至关重要。更高的稳定性允许试剂盒更长的储存时间。

Figure 5: Classification of ELISA assay kit products

ELISA应用

ELISA技术是定量特定靶蛋白的金标准，可提供快速、稳定且易于分析的结果。它可以应用于生物分子/小分子的定量分析、亲和力的评估或筛选以及重组蛋白或细胞因子活性的比较分析。它通常用于检测细胞因子、趋化因子、生长因子和其他靶标，也应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。

Figure 6: Technical applications of ELISA

在生物医学研究、细菌疾病和临床诊断中，ELISA作为一种成熟的免疫学检测方法，用于定量测量所需物质，如细胞因子和抗原。它的应用非常广泛。了解ELISA并选择合适的检测试剂盒可以极大地简化研究工作并获得显著的结果。

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