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提升CUT&Tag技能,就不怕卷单细胞ChIP技术了

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2023-06-26T09:36 (访问量:9554)

提升CUT&Tag技能,就不怕卷单细胞ChIP技术了

要问DNA-蛋白质互作技术谁最火?就不得不提CUT&Tag技术了!CUT&Tag技术自2019年问世以来,不断突破创新,从最初只能做组蛋白修饰,到现在越来越多转录因子见刊,甚至各种R-loop、G4结构的研究也被大量报道。更不要说单细胞技术爆火的现在,scCUT&Tag技术中,各种动物、细胞以及植物的文章见刊,并且CUT&Tag技术还衍生出了多靶标CUT&Tag,实现一个细胞,多个靶标的研究。

CUT&Tag技术发展历程
2019年4月 首次发表
2020年 大量组蛋白修饰、少量转录因子研究见刊

2021年 大量转录因子研究见刊

2021年1月 scCUT&tag在动物应用方向研究见刊

2021年12月 scCUT&tag在植物应用研究见刊
2022年3月 scCUT&tag +scRNA-seq单细胞多组学联合应用见刊
2022年3月 CUT&Tag2for1技术推出

2022年12月 nano-CUT&Tag推出

更多应用持续更新……

最近经常听到单细胞ChIP技术,小翌立马查阅资料去一探究竟,结果发现还是换汤不换药,这个单细胞ChIP技术不就是咱们scCUT&Tag么?

为了帮助大家提升CUT&Tag实验技能,小翌整理了之前的一些CUT&Tag知识,同时将CUT&Tag实验的甲醛交联方案和CUT&Tag-qPCR方案一起汇总,希望大家进一步提升CUT&Tag技能,后续如果也想尝试单细胞ChIP,或者是已经在做单细胞ChIP,咱们也能更得心应手。

CUT&Tag甲醛交联方案

1.对于细胞样本,将甲醛溶液加入细胞培养皿中,使甲醛终浓度为0.1%,室温条件下,摇床上交联2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ,交联结束后,立即加入甘氨酸到培养皿中(终浓度0.1 M),摇床继续摇15 min以终止交联,然后进行后续的细胞捕获(对于部分弱结合的转录因子,可将甲醛调为0.2%);
2.对于组织样本,将组织用剪刀剪成小块后加预冷的PBS(含1%BSA),加入甲醛溶液使甲醛终浓度为0.1%,室温摇床上摇2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ,交联结束后,立即加入甘氨酸到培养皿中(终浓度0.1 M),摇床继续摇15 min以终止交联,之后,用组织匀浆器匀浆,将组织匀浆后的溶液过细胞筛以获取细胞悬液,然后进行后续的细胞捕获(对于部分弱结合的转录因子,可将甲醛调为0.2%)。

【注】

A:在CUT&Tag实验开始前,我们需要确定实验方案。随着CUT&Tag技术的发展,科学家们发现有些目标蛋白质在研究时,轻微甲醛交联效果更好。之后,更多的研究表明,使用CUT&Tag技术研究不同蛋白时,所需的实验条件也不一样。做组蛋白修饰、强结合的转录因子(如CTCF、RNA polll等)无需甲醛交联。而一些弱结合的转录因子或转录辅因子则需要甲醛交联,并且甲醛交联的强度也不一样。常规的轻微甲醛交联条件为0.1%甲醛室温交联2 min,之后用0.1 M甘氨酸终止交联。

B:若在实验时,有添加甲醛进行轻微交联,那么后续加终止buffer后,步骤稍微有调整哦!甲醛交联后,蛋白酶K消化步骤调整为:向每个样品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K(此时磁珠会板结)(若样品较多,可一起提前配制)。全速涡旋样品约10 sec,混匀后瞬离,将样品置于PCR仪,55 ºC消化2 h (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。

CUT&Tag-qPCR方案

目前做CUT&Tag-qPCR时,有两种,一种是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR实验,一种是完成建库后进行qPCR。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qPCR实验。

qPCR 定量检测

qPCR试剂以翌圣的Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(Cat#11184)为例。

反应体系(推荐冰上配制)

使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
b) 模板浓度如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
c) 模板稀释cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
d) 反应体系推荐使用20 μL或50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制请于超净工作台内配制,并使用无核酸酶残留的枪头、反应管;推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染。

反应程序

快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

a) 退火温度和时间请根据引物和目的基因的长度进行调整。

b) 荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:

20 secApplied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 secApplied Biosystems 7300

32 secApplied Biosystems 7500

c) 熔解曲线:通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
1) 扩增曲线:标准扩增曲线为S型。
Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确;
Ct值小于10时,需要将稀释模板后,重新进行实验;
Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。
2) 熔解曲线:
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