上一期小V和大家一起学习了关于rAAV在肺部实验中的启动子、血清型以及注射方式的选择策略（『干货篇』AAV在肺部应用中的靶向策略），今天我们将和大家一起通过几个具体案例深入了解一下关于AAV在肺部研究中的应用策略。

维真生物AAV注射肺部案例展示

1、“SERPINB10 contributes to asthma by inhibiting the apoptosis of allergenic Th2 cells”
原文链接：https://respiratoryresearch.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12931-021-01757-1
哮*（Asthma）是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的慢性炎症性疾病，常伴随有气道炎症、气道高反应性、大量粘液分泌和气道重塑的特征。研究表明，辅助型T细胞2（Th2）及其分泌的细胞因子与哮*发病机制密切相关；丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员SERPINB10与哮*的过敏性炎症有关，但其在过敏性哮*Th2应答中的作用尚不清楚。
在本研究中，作者通过抑制小鼠SERPINB10表达（利用AAV6载体进行气管内注射），发现屋尘螨(HDM)诱导的气道炎症和Th2反应有所缓解，HDM诱导的Th2细胞因子分泌和HDM特异性IgE水平显著降低，且诱导了Th2的凋亡增加。本文揭示了SERPINB10通过抑制Th2细胞的凋亡促进哮*的炎症发生，阐明了SERPINB10在过敏性哮*Th2反应中的重要作用。

如图1所示，研究人员通过HDM诱导构建了哮*小鼠模型，借助AAV6下调SERPINB10的表达，结果发现小鼠肺组织中SERPINB10的转录水平和蛋白表达水平均显著降低，干扰率约为74.2%。AAV6-SERPINB10 shRNA对于HMD诱导的SERPINB10高表达同样可以起到很好的干扰效果，并表现为持久有效地抑制。

图1. AAV6-Serpinb10shRNA干扰效率检测

2、“circHIPK3 regulates lung fibroblast-tomyofibroblast transition by functioning as a competing endogenous RNA”
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-019-1430-7
特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，发病机制尚不完全清楚，迫切需要新的靶向药物来阻止其纤维化过程。肺内形成由肌成纤维细胞组成的纤维化灶和细胞外基质(ECM)蛋白的异常表达是IPF的显著病理特征，而肌成纤维细胞主要来源于成纤维细胞转化（FMT），因此，了解IPF中FMT过程的调控机制或许将会为IPF治疗提供新的靶点。circHIPK3已被鉴定在肺中高表达，且在人成纤维细胞中富集。然而，circHIPK3是否参与介导成纤维细胞的生物学功能尚不清楚。
研究人员利用博莱霉素(BLM)制备IPF小鼠模型，探究了circHIPK3在肺纤维化中的作用，发现circHIPK3在肺纤维化小鼠模型，FMT衍生的肌成纤维细胞中表达上调；沉默circHIPK3（通过AAV6载体进行气管内注射）可以在体内外抑制成纤维细胞增殖并改善FMT。从机制上来讲，circHIPK3作为内源性miR-338-3p的海绵调控FMT：circHIPK3通过抑制miR-338-3p活性导致FMT调控因子SOX4和COL1A1表达增加。总的来说，circHIPK3的干预可能为肺纤维化的治疗提供新的见解。

如图2所示，通过气管内注射AAV6-circHIPK3 shRNA显著降低了circHIPK3在肺中的表达，沉默circHIPK3后减弱了BLM诱导的肺纤维化小鼠中的胶原沉积，并降低了肌成纤维细胞标记物α-SMA和Col-1的表达水平。这些结果表明，circHIPK3沉默显著改善了BLM诱导的肺纤维化，抑制肺成纤维细胞增殖。

3、“Sirtuin 6 inhibits epithelial to mesenchymal transition during idiopathic pulmonary fibrosis via inactivating TGF-β1/Smad3 signaling”。
原文链接：https://www.oncotarget.com/article/17723/text/
特发性肺纤维化(IPF)是一种不可逆、进行性、平均生存期短的间质性肺疾病，其特征是细胞外基质(ECM)过度沉积和肺结构受损，目前尚无有效的治疗方法，迫切需要从机制上了解其发病机制，以开发治疗这一疾病的新方法。目前已发现上皮向间质转化（EMT）参与了特发性肺纤维化的发病机制，确定调节EMT或将间充质细胞去分化为上皮细胞的关键分子是抑制或逆转IPF的一种有吸引力的治疗策略。SIRT6参与控制衰老、癌症和新陈代谢，已被证明在心脏和肝脏具有抗纤维化功能。然而，SIRT6是否参与肺EMT，抑制特发性肺纤维化（IPF）尚不清楚。
在本研究中，研究人员首先通过体外研究发现，在TGF-β1诱导的A549细胞中Sirt6表达上调，且过表达Sirt6可负调控EMT进程，EMT相关转录因子的表达和间充质细胞行为。随后通过体内研究表明，通过AAV载体使Sirt6在小鼠肺部成功表达，可以消除博莱霉素（BLM）诱导的EMT样表型和肺纤维化，揭示了Sirt6在肺EMT过程中的关键作用，并可能成为特发性肺纤维化的一个潜在治疗靶点。

如图3所示，通过气管内注射AAV-Sirt6后，Sirt6在肺泡壁成功表达，Sirt6过表达明显消除了博来霉素诱导的EMT表型并缓解了肺纤维化。

腹腔注射表达lncRNA ZFAS1 的AAV5敲低载体后，明显减弱了BLM诱导的肺纤维化特征。此外，lncRNA ZFAS1的敲低显著增加了BLM诱导的PF大鼠模型肺组织中miR-150-5p的表达，并降低了SLC38A1 mRNA的表达，同时减弱了BLM诱导的炎性因子的表达、脂质过氧化和铁死亡。总的来说，lncRNA ZFAS1的下调通过调节miR-150-5p/SLC38A1通路显著减弱BLM诱导的肺纤维化和铁死亡（图4）。

肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞在HPH的发生发展中发挥重要作用，为确定ALDH2通过哪种细胞在HPH中发挥作用，研究者利用AAV1 -ICAM2-ALDH2和AAV2-SM22α-ALDH2分别在小鼠肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中特异性过表达ALDH2，发现尾静脉注射AAV病毒后，平滑肌细胞或内皮细胞中均出现强烈的GFP荧光信号，且右心室收缩压RVSP、右室肥厚指数RVH和肺血管肌化的检测结果表明，在肺动脉平滑肌细胞而非内皮细胞中特异性过表达ALDH2可抑制HPH的发生（图5）。