第89-101步

徕卡101

染色

从患者到病理学家，准备样本进行诊断需要细心、经验以及合理的流程。

徕卡特地为大家整理了取材、组织脱水、透明、浸蜡、包埋以及染色等（常规、特殊、IHC以及FISH）101步操作流程，帮助大家更有效、更简单地获得实验方案，避免错误的发生。

步骤八十九

使用高质量切片

🙆正确：使用薄的，切片平整的切片，需将其在玻片上充分干燥。免疫组化和原味杂交宜使用带电荷粘附载玻片。

🙅 错误：不平整，贴合不平整的切片的染色不均匀，背景会被不同程度染色。

这张低质量染色的切片（HPV）有凸起及背景染色。

步骤九十

确保最佳固定方式

🙆 正确：必须使用熟悉和恒定的固定条件（固定类型，pH，温度，时间）获得优质固定，以达到最佳结果。

🙅 错误：不稳定的固定条件会导致样本固定不足或固定过度，会使得实验结果不稳定并且无法排查问题原因。

A.在充分固定的扁桃体切片上进行 Kappa轻链mRNA原位杂交反应强烈，颜色锐丽。

B.在没有充分固定的扁桃体切片上进行 Kappa轻链mRNA原位杂交，反应十分微弱。

步骤九十一

避免组织粘附

🙆 正确：避免在捞片设备中使用蛋白质成分粘附剂（胶水，淀粉，明胶），特别是在使用带电荷的载玻片的时候。

🙅 错误：蛋白质成分粘附剂会覆盖在带电荷载玻片的表面，造成组织粘附不均匀，使得原位杂交试剂从凸起切片的下方流出，导致染色不均一。

切片粘附不完全和折叠导致染色不均一（HPV）。

步骤九十二

优化脱蜡和试剂应用

🙆正确：在脱蜡和水化时，一定要保证试剂高效均一的分布在样本表面。这样才能保证染色均一，结果恒定。

🙅 错误：脱蜡不完全会导致无法染色或染色不佳。前处理和染色过程中在样本表面形成的气泡也会产生问题。

95°烤片形成气泡导致染色不均一（HPV）。

步骤九十三

认真挑选探针

🙆 正确：根据探针特异性和敏感性进行选择。

🙅 错误：“我们只根据价格购买探针。”

两张扁桃体切片都使用原位杂交对kapa轻链mMA进行染色(BcIP/NBT)。两张切片使用寡核苷酸探针来源不同。切片A显色强烈而切片B显色不足并只有部分细胞被染色。

步骤九十四

阅读参数表

🙆 正确：了解你的探针。一定要检查参数表，来确认当前的实验方法是否适用于特定的探针。仔细控制温度和时间，提供最优化的杂交条件。即该条件下，探针和目标的特异结合最大化。

🙅 错误：不了解探针数据表：“我们用标准流程就行”。

两张湿疣切片都使用原位杂交对HPV进行染色。两张切片使用同样的DNA探针，但是杂交条件不同。切片A显色强烈而切片B显色失败。

步骤九十五

优化预处理条件

🙆 正确：选择合适的预处理和优化条件。取决于固定条件和组织类型。

🙅 错误：对不同的探针使用同样的酶预处理条，有时会导致染色体结果不佳。

这张切片使用 Poly d（T）阳性对照探针进行染色。染色结果表明这张切片被蛋白酶K过度消化。不但造成粘液上皮细胞质结构缺失，而且背景染色过重。

步骤九十六

仔细处理组织

🙆正确：仔细处理组织样本并及时固定可以限制由内源性RNA酶导致的RNA损失。

🙅 错误：处理组织时粗心大意，固定不及时，将会促进由内源性RNA酶导致更多的RNA损失。

扁桃体组织用 Poly d（T）阳性对照探针进行染色，由于RNA酶降解RNA导致的染色不足。

步骤九十七

使用合适的显色系统

🙆正确：选择灵敏的显色系统，优化孵育条件。

🙅 错误：即使探针已与目标结合，显色系统灵敏度不够也可能导致染色不足，甚至阴性结果。

该扁桃体切片染色不足是由于显色系统灵敏度不够造成的。Lambda轻链的原位杂交使用了非聚合物的显色系统。

步骤九十八

避免试剂蒸发

🙆正确：在孵育过程中应避免探针和其他试剂的蒸发。由于需要长时间孵育，试剂干结是一个常见问题。必须使用高质量仪器。

🙅 错误：如果探针和其他试剂干结（通常在边缘处），干结处将形成过重和非特异染色。

该扁桃体切片用原位杂交对 kappa轻链进行显色。切片在甲酰胺杂交过程中变得过干，导致实验结果不稳定，产生非特异性反应。

步骤九十九

清洗步骤标准化

🙆正确：将整个流程的清洗步骤标准化（包括：持续时间，清洗液体积，搅动方式），如此可保证稳定的试验结果。

🙅 错误：同一探针在不同批次和日期的结果差异很大，这可能是由于操作者在清洗步骤上不够标准造成的。

这2张扁桃体切片用原位杂交对 kappa轻链进行显色。切片A显示过重的背景染色，而切片B背景清晰，这有可能就是由于切片A的清洗不足而造成的。

步骤一百

使用合适对照

🙆正确：每一批次都使用合适的对照。对照应包含阳性对照和阴性对照，阳性对照为已知阳性的组织，阴性对照是使用非特异探针的检測组织。

🙅 错误：“我们只在试验出现问题时才会使用质控片。如果每一轮实验都做质控片的话,大家没有耐心去看的。”

这张切片使用 Poly d(T)阳性对照探针进行染色。精确的染色表明该组织固定良好，RNA序列保存完整。

步骤一百零一

认真评估结果

🙆正确：评价染色后的切片和对照时，知道观察什么、观察哪里。任何一个承担原位杂交的工作人员都应该对该技术的原理有基本的了解，应知道哪里能找到阳性染色。

🙅 错误：无论在切片何处发现染色，都表明该次染色是成功的。

除了添加探针外，该扁桃体阴性对照切片完成了所有的原位杂交步骤。它表现出了铁血黄素，该物质天然即为棕色并可与DAB结合加深显色，这并非阳性染色。

本期是我们徕卡101样本诊断流程小贴士的最后一次分享，感谢大家一直以来的关注，我们希望通过这段时间的阅读，传递学术知识，并能够解决困扰大家的问题。未来我们还将带给大家更多的精彩！

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